Hemos visto que las enzimas de restricción permiten fragmentar el ADN; si éste ha de estudiarse, sin embargo, es preciso disponer de muchas copias del mismo. El proceso de amplificación se llama clonación y se lleva a cabo insertando el fragmento de ADN que ha de amplificarse en vectoes, que son determinadas moléculas de ADN capaces de reproducirse autónomamente. Los vectores utilizados en las técnicas de clonación son de diversos tipos: según sus dimensiones y la cantidad de ADN que consiguen producir, se subdividen, a grandes rasgos, en plásmidos, fagos, cósmidos y cromosomas artificiales de levadura llamados yac. Pasemos ahora a describirlos.
Además de su cromosoma circular de longitud aproximadamente igual a 4 millones de pares de bases, las bacterias poseen pequeñas moléculas de ADN circular llamadas plásmidos, integradas por unos pocos miles de pares de bases.
Estas moléculas de ADN bacteriano son capaces de duplicarse de manera autónoma respecto del cromosoma bacteriano principal. En un principio, los plásmidos fueron definidos como elementos independientes del cromosoma bacteriano, pero en la actualidad se sabe que algunos plásmidos, llamados episomas, pueden entrar y salir del cromosoma principal en calidad de elementos génicos móviles. Los plásmidos son portadores de genes que confieren a las bacterias su resistencia a antibióticos tales como la tetraciclina y la kanamicina, así como de un principio de replicación, llamado ori, que permite la replicación de los plásmidos en el interior de las bacterias. El número de plásmidos presentes en una célula bacteriana depende del tipo de plásmidos bacterianos: uno que posee una alta velocidad de replicación hasta alcanzar un número de copias que va de las 10 a las 200 por célula, y otro que se duplica más lentamente con velocidad casi igual a la del cromosoma principal, por lo que existen uno o dos ejemplares del mismo en la célula. Los plásmidos utilizados en las técnicas del ADN recombinante son los del primer tipo. Veamos ahora cómo se produce la clonación del ADN en un plásmido.
La estrategia básica consiste en utilizar la misma enzima de restricción, como por ejemplo el EcoRI, para cortar tanto el fragmento de ADN que ha de amplificarse como el plásmido en que dicho ADN ha de insertarse. Se forman así dos moléculas con extremos cohesivos compatibles y que, por tanto, pueden asociarse por complementariedad de las bases; se procede luego a una ligación, es decir, una reacción en la que los dos tipos de moléculas de ADN, en presencia de la enzima ADN ligasa, se enlazan una con otra. Este procedimiento produce plásmidos híbridos o, para decirlo con más propiedad, recombinantes, que llevan intercalado ADN extraño (exógeno). Estos plásmidos se integran luego en células bacterianas hospedadoras mediante un proceso llamado transformación celular. En condiciones de crecimiento adecuadas, la célula bacteriana hospedadora se divide y genera millones de células, cada una de las cuales contiene varios ejemplares del plásmido recombinante. Este procedimiento permite obtener muchas moléculas del plásmido y de su inserción; además, dado que los plásmidos recombinantes son portadores de resistencia a un determinado antibiótico, se puede utilizar un medio de cultivo que contenga el antibiótico para seleccionar únicamente aquellas células bacterianas que contienen las moléculas de ADN recombinante. Los plásmidos hacen posible el ligamiento de fragmentos de ADN exógeno de una longitud del orden de los 10.000 pares de bases.
En consecuencia, para que resulte utilizable en la amplificación de fragmentos de ADN exógeno, un vector plasmídico ha de poseer unas características determinadas: la presencia en su ADN de una secuencia que le confiera la capacidad de autoreplicarse; la presencia de un gen que lo haga resistente a un antibiótico para poder seleccionar los clones de células bacterianas que contengan los plásmidos; y, por último, la presencia de secuencias de reconocimiento por parte de enzimas de restricción para poder integrar los fragmentos de ADN exógeno.
Otra categoría de vectores utilizados en biología molecular es la de los bacteriófagos. Por las reducidas dimensiones de su genoma y su facilidad de crecimiento in vitro, los fagos se han tomado como modelo en numerosas investigaciones y han contribuido en gran medida a incrementar los conocimientos de la genética moderna. Uno de los bacteriófagos más famosos es el fago lambda de la bacteria E. coli. Su genoma está constituido por una única molécula de ADN circular con doble hélice, integrada por 49.000 pares de bases, cuyos genes han sido identificados. Este virus suscita un gran interés por la complejidad de sus mecanismos. Cuando un fago lambda infecta una célula bacteriana puede comportarse de dos maneras distintas: puede ocurrir que se produzca su replicación, dando lugar a una numerosa progenie que destruya la célula hospedadora provocando su explosión, en cuyo caso se dice que el fago emprende un ciclo lítico; o bien puede elegir insertar su genoma vírico en el cromosoma bacteriano y convertirse en parte de él, en cuyo caso se dice que el fago sigue un ciclo lisógeno.
Cuando el genoma de un fago entra a formar parte del genoma bacteriano, recibe el nombre de profago o provirus y se duplica como parte del genoma bacteriano, transmitiéndose a las células bacterianas hijas.
Estos provirus, que constituyen una amenaza potencial para las células hospedadoras, se encuentran reprimidos e inactivos. De hecho, sólo en contadas ocasiones es posible inducirlos a que entren a formar parte del ciclo lítico, destruyendo así su célula hospedadora.
Todo ello pone de manifiesto la importancia que encierra el estudio de este virus para entender el comportamiento de otros que, como el polioma y el SV40, producen tumores en los mamíferos. Volviendo ahora a los fagos considerados como vectores de clonación, han sido utilizados en este campo por el hecho de que resulta posible insertar en su genoma fragmentos de ADN exógeno mayores que los contenidos en los plásmidos. En particular, en el genoma del fago lambda existe una región de ADN que no contiene genes esenciales para su supervivencia: la constatación de esta circunstancia ha llevado a los ingenieros genéticos a construir fagos lambda que pueden contener hasta 15.000 pares de bases de ADN exógeno para su clonación, sin perder su capacidad infecciosa.
La estrategia de clonación es conceptualmente la misma que la utilizada para los plásmidos: tanto el ADN circular del fago como los fragmentos que han de insertarse, se cortan con la misma enzima de restricción.
Además de su cromosoma circular de longitud aproximadamente igual a 4 millones de pares de bases, las bacterias poseen pequeñas moléculas de ADN circular llamadas plásmidos, integradas por unos pocos miles de pares de bases.
Estas moléculas de ADN bacteriano son capaces de duplicarse de manera autónoma respecto del cromosoma bacteriano principal. En un principio, los plásmidos fueron definidos como elementos independientes del cromosoma bacteriano, pero en la actualidad se sabe que algunos plásmidos, llamados episomas, pueden entrar y salir del cromosoma principal en calidad de elementos génicos móviles. Los plásmidos son portadores de genes que confieren a las bacterias su resistencia a antibióticos tales como la tetraciclina y la kanamicina, así como de un principio de replicación, llamado ori, que permite la replicación de los plásmidos en el interior de las bacterias. El número de plásmidos presentes en una célula bacteriana depende del tipo de plásmidos bacterianos: uno que posee una alta velocidad de replicación hasta alcanzar un número de copias que va de las 10 a las 200 por célula, y otro que se duplica más lentamente con velocidad casi igual a la del cromosoma principal, por lo que existen uno o dos ejemplares del mismo en la célula. Los plásmidos utilizados en las técnicas del ADN recombinante son los del primer tipo. Veamos ahora cómo se produce la clonación del ADN en un plásmido.
La estrategia básica consiste en utilizar la misma enzima de restricción, como por ejemplo el EcoRI, para cortar tanto el fragmento de ADN que ha de amplificarse como el plásmido en que dicho ADN ha de insertarse. Se forman así dos moléculas con extremos cohesivos compatibles y que, por tanto, pueden asociarse por complementariedad de las bases; se procede luego a una ligación, es decir, una reacción en la que los dos tipos de moléculas de ADN, en presencia de la enzima ADN ligasa, se enlazan una con otra. Este procedimiento produce plásmidos híbridos o, para decirlo con más propiedad, recombinantes, que llevan intercalado ADN extraño (exógeno). Estos plásmidos se integran luego en células bacterianas hospedadoras mediante un proceso llamado transformación celular. En condiciones de crecimiento adecuadas, la célula bacteriana hospedadora se divide y genera millones de células, cada una de las cuales contiene varios ejemplares del plásmido recombinante. Este procedimiento permite obtener muchas moléculas del plásmido y de su inserción; además, dado que los plásmidos recombinantes son portadores de resistencia a un determinado antibiótico, se puede utilizar un medio de cultivo que contenga el antibiótico para seleccionar únicamente aquellas células bacterianas que contienen las moléculas de ADN recombinante. Los plásmidos hacen posible el ligamiento de fragmentos de ADN exógeno de una longitud del orden de los 10.000 pares de bases.
En consecuencia, para que resulte utilizable en la amplificación de fragmentos de ADN exógeno, un vector plasmídico ha de poseer unas características determinadas: la presencia en su ADN de una secuencia que le confiera la capacidad de autoreplicarse; la presencia de un gen que lo haga resistente a un antibiótico para poder seleccionar los clones de células bacterianas que contengan los plásmidos; y, por último, la presencia de secuencias de reconocimiento por parte de enzimas de restricción para poder integrar los fragmentos de ADN exógeno.
Otra categoría de vectores utilizados en biología molecular es la de los bacteriófagos. Por las reducidas dimensiones de su genoma y su facilidad de crecimiento in vitro, los fagos se han tomado como modelo en numerosas investigaciones y han contribuido en gran medida a incrementar los conocimientos de la genética moderna. Uno de los bacteriófagos más famosos es el fago lambda de la bacteria E. coli. Su genoma está constituido por una única molécula de ADN circular con doble hélice, integrada por 49.000 pares de bases, cuyos genes han sido identificados. Este virus suscita un gran interés por la complejidad de sus mecanismos. Cuando un fago lambda infecta una célula bacteriana puede comportarse de dos maneras distintas: puede ocurrir que se produzca su replicación, dando lugar a una numerosa progenie que destruya la célula hospedadora provocando su explosión, en cuyo caso se dice que el fago emprende un ciclo lítico; o bien puede elegir insertar su genoma vírico en el cromosoma bacteriano y convertirse en parte de él, en cuyo caso se dice que el fago sigue un ciclo lisógeno.
Cuando el genoma de un fago entra a formar parte del genoma bacteriano, recibe el nombre de profago o provirus y se duplica como parte del genoma bacteriano, transmitiéndose a las células bacterianas hijas.
Estos provirus, que constituyen una amenaza potencial para las células hospedadoras, se encuentran reprimidos e inactivos. De hecho, sólo en contadas ocasiones es posible inducirlos a que entren a formar parte del ciclo lítico, destruyendo así su célula hospedadora.
Todo ello pone de manifiesto la importancia que encierra el estudio de este virus para entender el comportamiento de otros que, como el polioma y el SV40, producen tumores en los mamíferos. Volviendo ahora a los fagos considerados como vectores de clonación, han sido utilizados en este campo por el hecho de que resulta posible insertar en su genoma fragmentos de ADN exógeno mayores que los contenidos en los plásmidos. En particular, en el genoma del fago lambda existe una región de ADN que no contiene genes esenciales para su supervivencia: la constatación de esta circunstancia ha llevado a los ingenieros genéticos a construir fagos lambda que pueden contener hasta 15.000 pares de bases de ADN exógeno para su clonación, sin perder su capacidad infecciosa.
La estrategia de clonación es conceptualmente la misma que la utilizada para los plásmidos: tanto el ADN circular del fago como los fragmentos que han de insertarse, se cortan con la misma enzima de restricción.
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