Los Vectores de Clonación

Hemos visto que las enzimas de restricción permiten fragmentar el ADN; si éste ha de estudiarse, sin embargo, es preciso disponer de muchas copias del mismo. El proceso de amplificación se llama clonación y se lleva a cabo insertando el fragmento de ADN que ha de amplificarse en vectoes, que son determinadas moléculas de ADN capaces de reproducirse autónomamente. Los vectores utilizados en las técnicas de clonación son de diversos tipos: según sus dimensiones y la cantidad de ADN que consiguen producir, se subdividen, a grandes rasgos, en plásmidos, fagos, cósmidos y cromosomas artificiales de levadura llamados yac. Pasemos ahora a describirlos.

Además de su cromosoma circular de longitud aproximadamente igual a 4 millones de pares de bases, las bacterias poseen pequeñas moléculas de ADN circular llamadas plásmidos, integradas por unos pocos miles de pares de bases.

Estas moléculas de ADN bacteriano son capaces de duplicarse de manera autónoma respecto del cromosoma bacteriano principal. En un principio, los plásmidos fueron definidos como elementos independientes del cromosoma bacteriano, pero en la actualidad se sabe que algunos plásmidos, llamados episomas, pueden entrar y salir del cromosoma principal en calidad de elementos génicos móviles. Los plásmidos son portadores de genes que confieren a las bacterias su resistencia a antibióticos tales como la tetraciclina y la kanamicina, así como de un principio de replicación, llamado ori, que permite la replicación de los plásmidos en el interior de las bacterias. El número de plásmidos presentes en una célula bacteriana depende del tipo de plásmidos bacterianos: uno que posee una alta velocidad de replicación hasta alcanzar un número de copias que va de las 10 a las 200 por célula, y otro que se duplica más lentamente con velocidad casi igual a la del cromosoma principal, por lo que existen uno o dos ejemplares del mismo en la célula. Los plásmidos utilizados en las técnicas del ADN recombinante son los del primer tipo. Veamos ahora cómo se produce la clonación del ADN en un plásmido.

La estrategia básica consiste en utilizar la misma enzima de restricción, como por ejemplo el EcoRI, para cortar tanto el fragmento de ADN que ha de amplificarse como el plásmido en que dicho ADN ha de insertarse. Se forman así dos moléculas con extremos cohesivos compatibles y que, por tanto, pueden asociarse por complementariedad de las bases; se procede luego a una ligación, es decir, una reacción en la que los dos tipos de moléculas de ADN, en presencia de la enzima ADN ligasa, se enlazan una con otra. Este procedimiento produce plásmidos híbridos o, para decirlo con más propiedad, recombinantes, que llevan intercalado ADN extraño (exógeno). Estos plásmidos se integran luego en células bacterianas hospedadoras mediante un proceso llamado transformación celular. En condiciones de crecimiento adecuadas, la célula bacteriana hospedadora se divide y genera millones de células, cada una de las cuales contiene varios ejemplares del plásmido recombinante. Este procedimiento permite obtener muchas moléculas del plásmido y de su inserción; además, dado que los plásmidos recombinantes son portadores de resistencia a un determinado antibiótico, se puede utilizar un medio de cultivo que contenga el antibiótico para seleccionar únicamente aquellas células bacterianas que contienen las moléculas de ADN recombinante. Los plásmidos hacen posible el ligamiento de fragmentos de ADN exógeno de una longitud del orden de los 10.000 pares de bases.

En consecuencia, para que resulte utilizable en la amplificación de fragmentos de ADN exógeno, un vector plasmídico ha de poseer unas características determinadas: la presencia en su ADN de una secuencia que le confiera la capacidad de autoreplicarse; la presencia de un gen que lo haga resistente a un antibiótico para poder seleccionar los clones de células bacterianas que contengan los plásmidos; y, por último, la presencia de secuencias de reconocimiento por parte de enzimas de restricción para poder integrar los fragmentos de ADN exógeno.

Otra categoría de vectores utilizados en biología molecular es la de los bacteriófagos. Por las reducidas dimensiones de su genoma y su facilidad de crecimiento in vitro, los fagos se han tomado como modelo en numerosas investigaciones y han contribuido en gran medida a incrementar los conocimientos de la genética moderna. Uno de los bacteriófagos más famosos es el fago lambda de la bacteria E. coli. Su genoma está constituido por una única molécula de ADN circular con doble hélice, integrada por 49.000 pares de bases, cuyos genes han sido identificados. Este virus suscita un gran interés por la complejidad de sus mecanismos. Cuando un fago lambda infecta una célula bacteriana puede comportarse de dos maneras distintas: puede ocurrir que se produzca su replicación, dando lugar a una numerosa progenie que destruya la célula hospedadora provocando su explosión, en cuyo caso se dice que el fago emprende un ciclo lítico; o bien puede elegir insertar su genoma vírico en el cromosoma bacteriano y convertirse en parte de él, en cuyo caso se dice que el fago sigue un ciclo lisógeno.

Cuando el genoma de un fago entra a formar parte del genoma bacteriano, recibe el nombre de profago o provirus y se duplica como parte del genoma bacteriano, transmitiéndose a las células bacterianas hijas.

Estos provirus, que constituyen una amenaza potencial para las células hospedadoras, se encuentran reprimidos e inactivos. De hecho, sólo en contadas ocasiones es posible inducirlos a que entren a formar parte del ciclo lítico, destruyendo así su célula hospedadora.

Todo ello pone de manifiesto la importancia que encierra el estudio de este virus para entender el comportamiento de otros que, como el polioma y el SV40, producen tumores en los mamíferos. Volviendo ahora a los fagos considerados como vectores de clonación, han sido utilizados en este campo por el hecho de que resulta posible insertar en su genoma fragmentos de ADN exógeno mayores que los contenidos en los plásmidos. En particular, en el genoma del fago lambda existe una región de ADN que no contiene genes esenciales para su supervivencia: la constatación de esta circunstancia ha llevado a los ingenieros genéticos a construir fagos lambda que pueden contener hasta 15.000 pares de bases de ADN exógeno para su clonación, sin perder su capacidad infecciosa.

La estrategia de clonación es conceptualmente la misma que la utilizada para los plásmidos: tanto el ADN circular del fago como los fragmentos que han de insertarse, se cortan con la misma enzima de restricción.

Clonación del ADN

El proceso de clonación de un gen consta de tres etapas. La primera requiere proceder a la elección del ADN que ha de clonarse: puede tratarse de ADN genómico extraído directamente de los cromosomas, o bien ADN copiado del ARN mensajero, que se llama ADN complementario (o ADN copia) y se escribe abreviadamente ADNc. El ADNc es sintetizado por una enzima particular, la transcriptasa inversa, que, al contrario de lo que sucede en la transcripción normal, usa como plantilla el ARN mensajero y transcribe una molécula idéntica de ADN.

La segunda etapa consiste en la preparación de los fragmentos de ADN que han de insertarse en vectores, que pueden estar, en consecuencia, constituidos por ADN genómico o por ADNc, y en la introducción de los vectores recombinantes en células bacterianas; éstas se hacen crecer y multiplicarse en cápsulas con un medio de cultivo adecuado, enriquecido con un antibiótico que impide el crecimiento de las células bacterianas sensibles a la acción de los antibióticos.

Cada célula bacteriana que se haya convertido en resistente al antibiótico puede, de esta manera, proliferar formando una colonia de células hijas todas ellas genéticamente idénticas; en consecuencia, esta colonia se compondrá de bacterias que han hospedado un vector con el mismo fragmento de ADN exógeno.

Cada cápsula contiene muchas colonias distintas de bacterias. Una cosecha de fragmentos de ADN exógeno distintos (por consiguiente, de colonias bacterianas diferentes) constituye una biblioteca genómica o genoteca. Una genoteca puede contener, en teoría, todo el ADN cromosómico fraccionado de un mamífero, o bien moléculas de ADNc obtenidas de todos los ARN mensajeros producidos por una determinada célula eucariota. Una genoteca es como una biblioteca carente de un índice que registre la posición de cada libro en particular, es decir, de los clones que contienen un fragmento determinado. Para identificar una colonia determinada que contenga la secuencia de ADN preseleccionada, es menester pasar a la tercera etapa, consistente en el cribado (screening) mediante una sonda de reconocimiento. Una sonda consiste en un segmento de ADN formado por una secuencia de bases complementarias del fragmento que ha de identificarse; es decir, una secuencia de ácidos nucleicos que se aparea con el fragmento dado. Para identificarla, la sonda ha de marcarse con fósforo radiactivo, 32P.

Supongamos que se desea clonar una porción de ADN donde se cree que está contenido un gen. Para empezar, la porción ha de subdividirse en fragmentos de dimensiones adecuadas para que puedan ser clonados en el vector previamente seleccionado, como por ejemplo el fago lambda. Los vectores fágicos, en los que están insertos los fragmentos que han de ser clonados, se empaquetan luego in vitro formando partículas fágicas, capaces de infectar las bacterias al introducir su ADN en las células hospedadoras. A continuación, las células bacterianas infectadas se "encapsulan", formando así una genoteca constituida por un número de placas fágicas que varía entre algunos miles y varios millones; cada una contiene un segmento distinto del ADN clonado.

Una vez encapsulada la genoteca, se obtiene una copia de ella depositando sobre la cápsula un filtro de nitrocelulosa; de esta manera, cada placa se transfiere al filtro, el cual se convierte en una copia exacta de la cápsula. Los filtros reciben luego un tratamiento especial para que el ADN de las placas se fije a la nitrocelulosa. En ese momento se procede al cribado, que se consigue incubando la copia de nitrocelulosa con una sonda de ácido nucleico. La sonda está constituida precisamente por una secuencia nucleótida, marcada con el fósforo radiactivo, que es complementaria de una porción del gen que se busca. La sonda radiactiva se unirá con las secuencias que encuentre en el filtro y que le sean complementarias; este proceso se denomina hibridación. Tras la hibridación, los filtros se lavan para eliminar la sonda que no se ha unido a ninguna secuencia, de manera que sólo queden aquellas moléculas de sonda firmemente unidas a las secuencias complementarias que presente el ADN fágico en el filtro de nitrocelulosa. La determinación de la sonda que se ha unido se consigue exponiendo los filtros sobre una placa sensible a los rayos X (autorradiografía), en la que aparecerán manchas oscuras allí donde la sustancia esté presente. De este modo, la posición de la sonda queda marcada por una mancha sobre la placa de exposición. Superponiendo esta última a la cápsula original, se podrán identificar las placas fágicas con secuencias complementaria y el clon que interesa encontrar.

Una vez aislado un fragmento de ADN genómico o de ADNc de una genoteca, se puede estudiar su posición precisa en el genoma de un organismo. Para ello se utiliza el método del Southern blotting, consistente en un proceso de "absorción" y que resulta muy eficiente para estudiar la estructura de los genes. Para llevar a cabo un Southern blotting, el ADN genómico se corta con enzimas de restricción; los fragmentos resultantes se separan de acuerdo con su longitud mediante electroforesis en un gel de agar. Se aplica sobre el gel un papel de filtro de nitrocelulosa, sobre el cual se transfieren y se fijan los fragmentos de ADN por absorción de una solución salina. De esta manera, se reproduce sobre el filtro de nitrocelulosa una copia exacta del ADN. El filtro se hibrida después con una sonda marcada que es específica para el gen en cuestión; la sonda solamente se hibridará con aquellos fragmentos de ADN genómico que le sean complementarios y la autorradiografía del filtro señalará su posición. A continuación, se podrá trazar un mapa físico del gen a partir de las dimensiones de los fragmentos, cribando las secuencias de reconocimiento de las enzimas de restricción. Comparando esta muestra de ADN con otras se puede localizar diferencias en el tamaño y el número de los fragmentos, que permiten poner de manifiesto anomalías tales como deleciones o translocaciones del gen. Las anomalías de este tipo son, de hecho, la causa de muchas enfermedades genéticas.

Genes que producen el Cáncer

La técnica del ADN recombinante posee muchas aplicaciones al estudio del cáncer. En 1911 P. Rous descubrió que extractos purificados de células tumorales de pollo podían causar nuevos tumores si se inoculaban en pollos sanos; Rous había descubierto un virus tumoral que provoca el sarcoma en el pollo.

Este descubrimiento supuso un giro en el enfoque del estudio del cáncer. Las células cancerosas se distinguen principalmente por transmitir a las células hijas las mismas características patológicas. Se ha demostrado, de hecho, que muchos tumores son clónicos. El estudio de las sustancias químicas causantes de tumores en animales de laboratorio aportó otra evidencia de la naturaleza genética del cáncer: todas las sustancias cancerosas son también agentes mutágenos, es decir, sustancias que alteran el ADN.

Esta observación sugirió la posibilidad de que toda transformación de células normales en cancerosas implicara una alteración genética. Todas las células normales de un cultivo poseen una serie de características comunes: crecen ordenadamente hasta recubrir la superficie de la cápsula de cultivo, formando un único estrato; por un efecto denominado inhibición de contacto, su crecimiento queda bloqueado cuando cada célula entra en contacto con otra célula situada junto a ella; las células solamente crecen si están ancladas al fondo de la cápsula; la proliferación celular requiere determinadas sustancias llamadas también factores de crecimiento.

Las células tumorales, es decir las células transformadas, poseen características de crecimiento completamente distintas: no experimentan la inhibición de contacto y crecen desordenadamente, unas encima de otras, formando muchos estratos celulares; a menudo, no necesitan factores de crecimiento para proliferar, ni se anclan al fondo de la cápsula. Además, si se inoculan células transformadas a ratones con el sistema inmunitario deprimido (llamados ratones desnudos), éstas causan la aparición de tumores.

El descubrimiento de que ciertos virus, al integrarse en el genoma de la célula hospedadora, son capaces de transformarla en neoplásica, ha sugerido la existencia, en el minúsculo genoma de estos virus, de genes capaces de inducir grandes alteraciones en el comportamiento celular. La transformación celular solamente se produce, por tanto, cuando el ADN o el ARN de un virus tumoral se integra en el de una célula hospedadora y se transmite permanentemente a la descendencia. Los virus tumorales contienen genes, llamados oncogenes, que son los responsables de la transformación celular. Estos genes codifican la síntesis de proteínas que controlan el ciclo vital del virus, como la duplicación y la transcripción del ADN. Se cree que la capacidad que poseen los oncogenes de transformar una célula deriva, precisamente, de esa actividad. Cuando un virus infecta una célula de un animal, precisa de enzimas celulares para duplicar su ADN y, en consecuencia, estimula a la célula a producirlos; así, cuando el ADN vírico se inserta en el genoma celular, el oncogen estimula a la célula a proliferar indefinidamente.

Puede afirmarse que este es, a grandes rasgos, el mecanismo básico de la aparición de muchos tumores. Hasta el momento se conocen varios oncogenes, que se clasifican de acuerdo con la función de regulación celular que cumplen las proteínas codificadas por ellos.

Los Ratones Transgénicos

Hemos visto cómo la introducción de genes eucariotas en células receptoras ha posibilitado el estudio de la expresión de estos genes, es decir, su comportamiento en el conjunto de la célula. Pero otro adelanto técnico de la biología molecular permite estudiar genes eucariotas aislados en el contexto del control genético del desarrollo de los organismos superiores. Para ello, se introducen genes exógenos en embriones de ratón durante su desarrollo. Tras haber introducido los genes en células embrionarias y una vez que se han integrado en el genoma hospedador, los individuos adultos que proceden de estos embriones manipulados pueden proporcionar muchas informaciones sobre el efecto fenotípico del gen introducido.

De hecho, los ratones tratados de esta manera proporcionan modelos muy útiles para comprender el desarrollo, en el hombre, de numerosas enfermedades, principalmente el cáncer.

La técnica más eficiente para introducir ADN exógeno en embriones de ratón consiste en procede a una microinyección de genes clonados en células huevo fecundadas que se encuentren en la fase en que todavía contienen los dos pronúcleos, es decir, el núcleo del oocito y el del espermatozoo, inmediatamente antes de que éstos se fusionen para formar el núcleo del zigoto, primera célula del desarrollo embrionario.

Tras el acoplamiento de los ratones, se extraen las células huevo fecundadas de los oviductos femeninos, y en uno de los dos pronúcleos de dichas células se inyecta el gen preseleccionado mediante una finísima micropipeta de vidrio. Los embriones manipulados se implantan luego en el útero de una madre adoptiva. El porcentaje de embriones que sobrevive a la manipulación y se desarrolla normalmente hasta el final de la gestación, varía entre el 10 y el 30%; de éstos, solamente el 40% presenta ADN exógeno integrado en los cromosomas.

Los ratones que han adquirido el gen exógeno se llaman transgénicos y se dice que el gen introducido es un transgen.

Para verificar, finalmente, si el transgen se ha integrado efectivamente es preciso controlar a los ratones tres semanas después de su nacimiento, retirando ADN de un pequeño fragmento del tejido de la cola; la muestra de ADN se analiza entonces con un Southern blot.

El ADN exógeno microinyectado en las células huevo fecundadas se integra establemente en el genoma, gracias a lo cual se transmite a todas las células somáticas que proceden de las células germinales en cuestión.

Biotecnologías

Los importantes éxitos obtenidos por las técnicas del ADN recombinante en el campo de la investigación biológica han llevado a aplicarlas también en la producción de fármacos, en la medicina, en la agricultura y en la industria.

Las biotecnologías permiten producir proteínas humanas a partir del ADN recombinante. La insulina ha sido una de las primeras proteínas humanas producidas mediante ingeniería genética. La insulina es una hormona muy importante que regula el metabolismo de los azúcares: la producen unas determinadas células del páncreas y se incorpora directamente al flujo sanguíneo. La diabetes es una enfermedad provocada por la falta de insulina y puede curarse con la administración diaria de esta hormona.

Antes de que se descubriera el ADN recombinante, la insulina suministrada a los pacientes se extraía del páncreas de cerdo o de ternera; esta insulina, aunque es también biológicamente activa en el hombre, presenta pequeñas diferencias en la secuencia de aminoácidos respecto de la molécula humana. Las diferencias causaban en algunos individuos graves reacciones inmunitarias. El problema quedó resuelto con la insulina obtenida a partir del ADN recombinante, ya que esta es idéntica a la que el hombre produce fisiológicamente. La técnica consiste en la síntesis química del gen humano encargado de codificar la insulina y en su clonación en vectores plasmídicos transferidos a células de E. coli en las que el gen se expresa a niveles altos.

Tras purificarla, la insulina así obtenida es apta para su uso.

Esta tecnología se aprovecha también para la producción de vacunas como la de la hepatitis vírica B. Antes de disponer de la técnica del ADN recombinante, las vacunas de obtenían a partir de derivados muertos de los virus infecciosos, o bien de virus vivos modificados de tal manera que resultasen incapaces de reproducirse una vez inoculados en el organismo. Su funcionamiento consistía en asegurar la presencia de antígenos víricos en las células del sistema inmunitario, los linfocitos B o T, fomentando una respuesta inmunitaria en el caso que el organismo entrara en contacto con el virus infeccioso.

Sin embargo, las vacunas así obtenidas pueden resultar peligrosas por el hecho de estar contaminadas con el propio virus, lo que implica el riesgo de que provoquen la infección del organismo al que se inoculan (en realidad, la producción de vacunas con la tecnología del ADN recombinante representa una gran esperanza para la medicina moderna, ya que permite confeccionar vacunas integradas únicamente por la proteína de superficie del virus (o de la bacteria) que es capaz de inducir la respuesta inmunitaria.

El ADN recombinante y el Sida

Las tecnologías del ADN recombinante desempeñan un papel esencial en el estudio de los complejos mecanismos que regulan el ciclo del virus del sida. En 1981 los Centros para el control de las enfermedades en los EUA constataron un aumento en la incidencia de dos enfermedades muy poco frecuentes hasta entonces: un tipo de pulmonía causada por el Pneumocystis carinii, y un tumor de piel, el sarcoma de Kaposi.

En los pacientes, ambas patologías aparecían asociadas a un déficit del sistema inmunitario. Un año más tarde se identificó una nueva enfermedad a la que se dio el nombre de síndrome de inmunodeficiencia adquirida (sida). En seguida se puso de manifiesto que el síndrome estaba provocado por un agente infeccioso que se transmitía a través de humores corporales, transfusiones sanguíneas y derivados de la sangre como el factor VIII utilizado en la terapia de la hemofilia; en 1983 se aisló el virus causante del sida, bautizado como VIH.

El VIH es un retrovirus con genoma de ARN que la transcriptasa inversa se encarga de transcribir en ADN complementario, para así integrarse en el genoma de la célula diana. Los métodos de la biología molecular han permitido descubrir que el VIH es mucho más complejo que los demás retrovirus, ya que su genoma, de 9.200 pares de bases, posee por lo menos seis genes de más. De hecho, todos los retrovirus tienen tres genes (gag, env, pol) que codifican la síntesis de proteínas reguladoras de su ciclo vital y su envoltura, mientras que el VIH posee otros, como los genes tat y rev, implicados en la expresión génica del virus. La figura muestra el conocimiento que actualmente se tiene del ciclo vital de este virus. El virión VIH, recubierto de una glicoproteína, se une a los receptores (los receptores son proteínas situadas sobre la superficie externa de la membrana celular. En la comunicación entre células distintas, intervienen en la transmisión del mensaje) de membrana CD4. Dichos receptores se encuentran en la superficie de células del tipo correspondiente al denominado linfocito T coadyuvante o helper (los linfocitos T son células del sistema linfático implicadas en la respuesta inmunitaria.

Son de dos tipos: los citotóxicos y los coadyuvantes, llamados también CD4; solamente estos últimos actúan como células hospedadoras del retrovirus VIH). El retrovirus penetra en el interior de la célula CD4 donde libera su ARN, que la transcriptasa inversa se encarga de copiar en forma de ADN con doble hélice; el ADN vírico entra luego en el núcleo de la célula y se integra al ADN celular. El VIH es ahora, un provirus. En este momento, puede suceder que el ARN provírico abandone el núcleo y, sin pasar por el proceso de splicing, se traduzca en las proteínas que constituyen el interior del virus; estos componentes víricos se ensamblan entonces y forman nuevos retrovirus maduros, dispuestos a abandonar la célula para infectar otras. O bien puede ser que el ARN transcrito deje el núcleo tras haber sido cortado y produzca genes como tat, nef, rev; tat codifica la síntesis de la proteína Tat, que vuelve al núcleo y activa allí la transcripción de grandes cantidades de genes del VIH. La única terapia utilizada hasta ahora en la curación del sida ha consistido en el empleo de sustancias que bloquean la acción de la transcriptasa inversa, una enzima clave para el ciclo vital del retrovirus. Uno de estos fármacos es la AZT (azidotimidina), consistente en una forma modificada del nucleótido timidina en la que se eliminan los grupos 3' y 5' -OH de la ribosa, como en los ddNTP utilizados en el método de Sanger. La transcriptasa inversa incorpora la didesoxitimina normal, y la síntesis de la cadena de ADN se interrumpe.